Перевод статьи

Обновление:

Analysis of the parental origin of de novo MECP2 mutations and X chromosome inactivation in 24 sporadic patients with Rett syndrome in China.

[Analysis of the parental origin of MECP2 mutations in patients with Rett syndrome].

MECP2 Mutations in Sporadic Cases of Rett Syndrome Are Almost Exclusively of Paternal Origin

Мутации гена MECP2 в спорадических случаях синдрома Ретта передаются почти исключительно по отцовской линии.

Синдром Ретта (RTT) – это расстройство развития нервной системы, вызванное х- хромосомой, что почти всегда приводит к смерти эмбриона мужского пола.

RTT почти исключительно влияет на женское потомство и, в 99,5% всех случаев, носит спорадический характер в связи с первичной мутацией в гене MECP2. Семейные случаи RTT редки и связаны с X-хромосомной наследственностью от носителя, матери. Мы проанализировали родительское происхождение мутаций в MECP2 в спорадических случаях RTT, изучив связь между мутацией в гене MECP2 и интронным полиморфизмом в 27 семьях с 15 различными мутациями, анализ показал высокое преобладание мутаций отцовского происхождения в 26 из 27 случаев. Передача мутаций по отцовской линии не зависела от типа мутации и действовала как для точечных мутаций, так и для делиции.

Родители исследуемых не были особенно преклонного возраста. Мы пришли к выводу, что первичные мутации в RTT происходят почти исключительно в Х-хромосомы, передающейся по отцовской линии, и именно это, скорее всего, является причиной более высокого процента заболевания у женщин. Синдромом Ретта у мужчин недавно был описан в нескольких случаях семейного наследования данного заболевания. Идентификация родительского происхождения может быть полезной, при различении спорадических случаев RTT и потенциальной наследственной формы. Это различие позволит генетикам предлагать более специфические консультации и различать более высокий (передача мутации по материнской линии) и более низкий (передача мутации по отцовской линии) риск рецидива.

Введение:

Синдром Ретта (RTT [МИМ 312750]) является расстройством развития нервной системы, сцепленным с Х-хромосомой, которое проявляется почти исключительно у девочек. Он характеризуется умственной отсталостью, потерей приобретенных навыков (особенно целенаправленного использования рук), и замедлением роста головы. За нормальным дородовым и послеродовым развитием, которое длится 8-30 месяцев, следует застой развития и регрессия психических и двигательных способностей. Диагностические критерии и этапы болезни синдрома Ретта были описаны в 1985 году (Хагберг и другие. 1985). Общие клинические признаки: стереотипные движения рук, гипервентиляция, судороги, задержка роста, сколиоз, и вегетативная дисфункция. Распространенность заболевания оценивается в 1 /10,000-1 / 15000 рожденных девочек (Hagberg 1985). Мутации в MECP2 (MIM 300005) недавно были описаны несколькими группами, с вероятностью обнаружения 25% -90% (Amano и др., 2000; Амира др., 2000; Bienvenu др. 2000 года; Чидл и др. 2000 года; Huppke и др. 2000 года; Обаты и др. 2000 года; Сян др. 2000). Интересно, что во всех исследованиях низкий уровень обнаружения мутаций был зарегистрирован в семейных (наследственных) случаях RTT (Амир и другие. 2000 года; Чидл и др. 2000 года; Сян др. 2000). Не существует удовлетворительного объяснения расхождению между возможностью обнаружения в спорадических случаях и возможностью обнаружения в семейных случаях. До сегодняшнего дня существует лишь 5 отчетов описания мутации в гене MECP2 у мужчин (Ван и др 1999;. Клейтон-Смит и др, 2000;. Мелони и другие. 2000 года; Orrico др. 2000 года; Виллард др. 2000). В четырех из этих отчетов описываныредкие, задокументированные семейные случаи мутаций MECP2: в первом описан мальчик, страдавший от врожденной энцефалопатии, который дожил до возраста чуть более 1 года (Ван др., 1999);во втором описаны четверо взрослых братьев, страдавших от тяжелой редкой специфической умственной отсталости и двигательных расстройств (тремор покоя и замедленность движений) (Orrico и другие. 2000). В третьем говориться о двух мужчинах, страдавших от тяжелой умственной отсталости и прогрессивной спастичности (Мелони др 2000).;наконец в четвертом описаны два брата, пораженных тяжелой неонатальной энцефалопатией, которые умерли от тяжелой одышки, не дожив до 1 года (Виллар др.2000). Пятый отчет описывает спорадический случай – мальчика, с не смертельным расстройством развития нервной системы, имеющего соматический мозаицизм в гене MECP2 (Clayton-Smith и другие. 2000). Из-за очень малого числа выживших мальчиков с мутацией в MECP2, ген считается смертельно опасным для развития мужских эмбрионов. Эта гипотеза согласуется с результатами опытов на мышах с нокаутированным геном MECP2, в которых не рождались жизнеспособные самцы. (Тейт и др., 1996). Томас (1996), однако, предполагает, высокое соотношение мужчин и женщин на зародышевой линии мутаций для RTT и других сцепленных с Х-хромосомой доминантных генетических заболеваний; эта гипотеза предполагает, что отсутствие пораженных мужчин обусловлено лишь тем, что мужское потомство не наследует отцовскую Х-хромосому. Гипотеза Томаса подразумевает и то, что первоначально мутации происходят в отцовской Х-хромосоме, которая наследуется только потомством женского пола, и что пострадавшие женщины имеют значимые репродуктивные отклонения; несколько женщин являются носителями мутаций в гене MECP2, которые способны воспроизводиться вновь в редких семейных случаях. В этом исследовании, чтобы определить родительское происхождение мутаций, мы исследовали 27 случаев с RTT, заболевших из-за первичной мутации в гене MECP2.

Субъекты и методы

Субъекты:

Всего 144 пациентов с RTT, имеющих мутацию в гене MECP2, были изучены на наличие частых полиморфизмов в интроне 3. Обнаружение внутригенных однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) относительно близко к местонахождению мутации позволило соусилить мутацию и ОНП в том же ампликоне. Впоследствии они были клонированы для определения фазы мутации и ОНП родителей. Группа больных состояла из 132 немецких женщин, 2 итальянских женщин и 10 турецких женщин. Из 144 пациентов с RTT 42 случая были признаны информативными вследствие гетерозиготности, по крайней мере, одного полиморфизма в гене MECP2. С информированного согласия 25 пациентов с RTT были получены образцы крови обоих родителей. В двух случаях были доступны только образцы крови матери. Данные о возрасте родителей на момент деторождения были получены из клинических данных пациентов и были доступны у 25 отцов и 24 матерей.

Обнаружение мутации

Общую геномную ДНК получали из периферических лейкоцитов крови в соответствии со стандартными процедурами (Miller и другие. 1988). ПЦР-амплификация 2,3-кб фрагмента ДНК, содержащего экзон 3, интрон 3 и экзон 4, ген MECP2, а также обнаружение мутации в них были проведены, как описано раннее (Huppke и другие. 2000). Всякий раз возникновение мутации или уничтожение участка рестрикции подтверждалось ограничением ферментов пищеварения (рис. 1).

Идентификация полиморфных вариантов:

В поисках полиморфизмов в последовательности гена MECP2, мы проанализировали интрон 3 у 10 больных в прямой последовательности на автоматическом секвенаторе ABI 377 с компонентом В-RT-F (таблица 1). В интроне 3, в положении c.377_266, мы нашли новый часто встречающийся SNP (С / Т), который создает участки узнавания для ограничения энзима (фермента) AluI (AGCC / AGCT). Чтобы отобрать из группы пациентов с гетерозиготностью по этому полиморфизму, мы усилили в соответствующем месте ДНК из геномной ДНК пациента, с фланговыми интронными компонентами, и расщепили полученный результат с AluI (таблица 1). Полученный ПЦР-продукт, 248 п.н. в длину, постоянно содержит участки узнавания для AluI, в положениях 52-55. Второй участок узнавания AluIв положениях 77-80 фрагмента выборочно присутствует в этих продуктах, созданных на основе c.377_266T вариантов аллельных ген. В дальнейшем интронный полиморфизм, c.378_17delT, был обнаружен с помощью секвенирования из 3 части интрона 3, с компонентом Ретта Ex3-F1. В нашей лаборатории этот компонент обычно используется для анализа мутации ампликона, содержащего экзон 4. Скрининг на полиморфизм c.378_17delT во всех случаях был выполнен прямым секвенированием. Для определения частоты аллелей этих двух интронных полиморфизмов был установлен статус аллели для 56 не находящихся в родстве, здоровых белых женщин, как указано выше. Другие внутригенные ОНП были недавно опубликованы в публичной базе данных dbSNP и могут быть полезны для анализа фазы мутаций у пациентов в случаях неинформативных ОНП (dbSNP инвентарные номера rs760103, rs1474485, rs1042870, rs1042873, rs1474486 и).

Деление аллельных клеток, анализ сцепления и идентификация родительского происхождения

Для анализа были выбраны только пациенты с по меньшей мере, одним гетерозиготным интронным SNP (однонуклеотидный полиморфизм ). Поскольку RTT является расстройством Х-хромосомы, окончательная идентификация отцовских аллелей была получена путем сравнения генотипов гетерозиготных пациентов с такими же генотипами своих гемизиготных отцов. Затем были просто установлены аллели с материнской стороны. Для установления фазы мутации и родительского показательного аллеля, 2.3-кб ПЦР-продукты, начиная от экзона 3 до экзона 4,включающие мутацию пациента и информативный однонуклеотидный полиформизм были клонированы в pGEM-T Easy Вектор (Promega), в соответствии с инструкциями изготовителя, а затем преобразованы в pSure кишечной палочки (Stratagene). Для каждого пациента отбирали и скринировали путем ПЦР (полимеразная цепная реакция)колоний несколько колоний на наличие вставки с вектор-специфическими компонентами (таблица 1). Эта процедура привела к образованию 2,5-кб ПЦР-продуктов в случаях с успешным легированием 2,3 т.п.н. фрагмента в pGEM-T Easy Vector (2.3 кб специфической геномной ДНК _ 174 б.п. векторных последовательностей). Каждый 2,5 кб-ПЦР-продукт, созданный на основе одной колонии, был затем генотипирован для полиморфизма c.377_266CrT, с помощью ПЦР во второй раз после чего последовало либо ограничение резки AluI, или в случаях полиморфизма для c.378_17delT прямая последовательность. Те же 2,5-кб продукты затем тестировали на присутствие мутации пациента (таблица 1), чтобы определить связь между полиморфизмом и мутацией. Все проанализированные продукты ПЦР-колоний были однозначно гемизиготными как для интронных полиморфизмов, так и для мутации пациента или дикого типа аллелей, как и ожидалось. Это подчеркивает 100% специфичность такого подхода, практически безошибочного. Для каждого пациента мы проанализировали 5-10 клонов. У всех 27 пациентов мы смогли изучить клоны обоих аллелей. Статус родительских аллелей для соответствующих интронных полиморфизмов был определен амплификацией от геномной ДНК, сопровождающей либо ограничение фермента пищеварения или непосредственно секвенирование, как указано в подразделе «Идентификация полиморфных вариантов " (выше).

Результаты

Частота аллелей

В нашей группе пациентов (288 аллелей) частота варианта цитозина полиморфизма в интроне 3 была установлена равной - 83%, в то время как частота варианта тимина для этого полиморфизма - 17%. Это привело к расчетной гетерозиготности с частотой 28%; однако мы насчитали 44 гетерозиготных женщин в нашей группе из 144 изучаемых пациентов (30,5%). Установленное значение частоты варианта TTT полиморфизма в интроне 3 составляла 99%, и, соответственно, частота варианта ТТ ~ 1%. Три пациента в нашей группе были гетерозиготными по полиморфизму с.37817delT. Пятьдесят шесть здоровых женщин были обследованы на оба полиморфизма. В этом примере (112 аллелей) частота варианта цитозина в полиморфизме была установлена равной ок. 77%, в то время как частота варианта тимина - 23%. Ни для одной из женщин в контрольной группе не проводились анализы аллелей. Различия в аллельных частотах между контрольной группой и группой пациентов не являются статистически значимыми (для Тхеп1 .15c.377_266CrT полиморфизм,; их р 2,04 Р 120,27 х 1,18 для полиморфизма c.378_17delT,).

Спектр анализируемых мутаций и их связь с интронными полиморфизмами

В общей сложности у 27 пациентов, мы проанализировали 15 различных мутаций в гене MECP2,изучив родительское происхождение впервые обнаруженной мутации в RTT; у 9 пациентов миссенс-мутации, у 14 нонсенс-мутации, у 1 мутация сайта спласинга, у 1 малая вставка, у 2 делеция в экзоне 4 (одна делеция в 44 б.п., другая была в 156 б.п.). Анализ связи между интронным полиморфизмом c.377_266CrT и различными мутациями в гене MECP2 показал связь мутации с аллелем варианта цитозин у 16 пациентов и с аллелем варианта тимин у 9 пациентов. На основании аллельных частот для полиморфизма c.377_266CrT в нашей контрольной группе мы предсказали проявление мутаций в аллеле варианта цитозин в три раза чаще, чем в аллеле варианта тимин. В самом деле, доля мутаций, связанная с аллелями варианта тимин была немного выше, чем ожидалось (то есть, девять вместо шести), но эта разница не достигла статистической знаменательности (Р1 .35х р 0,86). Таким образом, наши результаты не указывают на преобладание мутации de novo ни для одного из полиморфных вариантов. Что касается полиморфизма c.378_17delT, мутация в гене MECP2 всегда обнаруживалась на аллеле ТТТ, который является самым частым аллелем; однако на наличие данного полиформизма были исследованы только два пациента.

Происхождение мутации:

Из 27 пациентов у 26 было выявлено отеческое происхождение мутации. Это весьма существенное значение преобладания отцовского происхождения. Более того отцовское происхождение не зависело от типа и локализации мутации и было установлено как для точечных мутаций, так и для делеций _156 ВР. Детальный анализ происхождение мутаций для всех исследованных пациентов показан в таблице 2. Только у одного пациента было выявлено материнское происхождение, миссенс-мутации (R133C) в МБД в продукте гена MECP2. Те же мутации были обнаружены в двух случаях с отцовским происхождением мутаций. Смешение проб ДНК отца и матери было исключено Y-специфичным ПЦР и Х-специфической амплификацией высоко полиморфного андрогенного рецептора гена. Мать пациентки не несла мутацию, по крайней мере, в ДНК, полученной из лейкоцитов крови.

Возраст родителей

Был определён средний родительский возраст на момент деторождения для семей с отцовским происхождением мутации. Итак, средний возраст отцов составлял – 31,3 (диапазон 23-42 года), и средний возраст матерей – 28,2 (диапазон – 22-36 года). В единственном случае передачи мутации по материнской линии, мать была в возрасте 25 лет, отец в возрасте 34. В прошлом десятилетии средний возраст матери в момент родов для немецкого населения составлял 27-30 года, возраст рожениц постоянно рос в течение этого периода времени; также в течение последних 10 лет, немецкие мужчины были, в среднем, на 2,86 лет старше, чем их партнеры на момент вступления в брак (Статистическое Федеральное Ведомство Висбаден 1985-99). У родителей больных RTT, ни возраст отца, ни возраст матери не отличались значительно от немецкого населения в целом.

Отцовское происхождение мутаций в RTT: почти исключительно женское заболевание.

Наряду с RTT существует, по крайней мере, 13 доминантных заболеваний с Х-хромосомой, вызванные мутацией de novo, которые имеют предположительно летальный фенотип у мужчин и как результат – ограничение репродуктивной функции у заболевших женщин. Летальный исход у мужчин – традиционное объяснение тому, что большинство известных больных – женщины и, в некоторых случаях, почти полное отсутствие пострадавших мужчин (Wettke-SchaЁ фер и Кантнер 1983). В 1996 году Томас предложил простую альтернативу этой теории: он предположил, что в случаях с мутациями de novo имеет место быть очень высокое соотношение случаев среди мужчин и женщин. Согласно этой модели, мужчины защищены от Х-хромосомных доминирующих заболеваний, потому что они не наследуют склонную к мутации отцовскую Х-хромосому. Наше исследование родительского происхождения мутаций MECP2 у пациентов со спорадическим RTT ясно дает убедительные доказательства, что почти во всех (26 из 27) случаях, мутации de novo в гене MECP2 возникают в отцовской Х-хромосоме. Предполагаем, что таким образом мужчины естественно защищены от спорадического вида RTT, которое вызвано мутацией de novo, и что RTT можно не считать смертельным заболеванием для мужчин. Следствием этой гипотезы является то, что заболевшие мужчины должны были бы наследовать Х-хромосому от матерей, которые являются носителями, или что мутация возникает заново из материнской хромосомы. Известно, что мутации в гене MECP2 недавно были описаны у мужчин в четыре семейных случаях: мальчика, страдавшего от врожденной энцефалопатии, который дожил до возраста чуть более 1 года (Ван др., 1999); четырех взрослых братьев, страдавших от тяжелой редкой специфической умственной отсталости и двигательных расстройств (тремор покоя и замедленность движений) (Orrico и другие. 2000); двух мужчин, страдающих от тяжелой умственной отсталости и прогрессивной спастичности (Мелони др 2000).;двух братьев, пораженных тяжелой неонатальной энцефалопатией, которые умерли от тяжелой одышки, не дожив до 1 года (Виллар др.2000). В дальнейшем случае постзиготная мутация, скорее всего, возникла заново из материнской хромосомы (Клейтон-Смит и др., 2000), что подтверждает жизнеспособность двух возможных причин заболевания у мужчин: наследование пораженных аллелей от матери, являющейся носителем, и мутация de novo на материнской Х-хромосоме. Исследования родительского происхождения мутаций de novo были выполнены как для аутосомно-доминантных заболеваний, так и для таких как синдром Аперта (Молони др., 1996) и синдром Крузона (Glaser и др., 2000) и опухолеспецифические заболевания, такие как MEN-2B (Карлсон и др., 1994) и NF-1 (Jadayel др., 1990). Для синдрома Аперта, синдрома Крузона и MEN-2B ,была доказана передача мутаций de novo исключительно по отцовской линии. В случае NF-1, происхождение мутаций de novo по отцовской линии оказалось весьма преобладающим. Возросший отцовский возраст, однако, был зарегистрирован только для синдрома Аперта и синдрома Крузона. При этих заболеваниях частота передачи мутаций исключительно по отцовской линии может положительно коррелироваться с числом клеточных делений сперматогенов. Этот механизм не может быть ответственным за высокое соотношение случаев мужчин и женщин с мутациями de novo в RTT, потому что нет увеличения отцовского возраста у отцов больных с RTT. Основные механизмы увеличения скорости мутаций у мужчин не ясны. Различные состояния активации Х-хромосомы в ооцитах и сперматоцитах являются отличительным элементом для двух зародышевых линий. Х-хромосома в ооцитах частично метилирована, тогда как X-хромосома в сперме гиперметилирована из-за эпигенетических модификаций, связанных с процессом инактивации хроматина (Гото и Монк 1998). Было высказано предположение, что спонтанное дезаминирование в остатке 5го-цитозина в положении 4 углеродного кольца может привести к преобразованию в тимин (Гото и Монк 1998). По сути, ~ 70% мутаций в MECP2 - переходы гена цитозин в тимин (Драгич др.2000), и это согласуется с возможностью гипермутации метилированных CpG динуклеотидов. Тем не менее, этот механизм не может объяснить другие типы мутаций в MECP2, такие как делеции или трансверсии, которые также возникают на отцовской Х-хромосоме. Возможно, что частота мутаций, независима от вида мутации и не отличается, как предполагалось, в женской и мужской зародышевой линии. На самом деле, недавно Bohossian др. (2000) поставил под сомнение гипотезу о более высоком коэффициенте мутаций у мужчин и обнаружил, что коэффициент соотношения частоты случаев мутаций у мужчин и женщин равен- 1,7. Если эти исследования также применимы к мутации в гене MECP2, то наблюдаемые смещения по отношению к родительскому происхождению мутаций должны быть постмутационным явлением (осложнением). Может быть, возможно, что мутации по женской Х-хромосоме вредны для ооцитов с выраженным мутированным белком. Этот механизм позволит снизить вероятность того, что ооциты с мутацией гена MECP2 могут быть оплодотворены. Только несколько ооцитов, избежавших этого отбора, станут затем основой для случаев RTT, которые возникают из-мутации de novo на материнской Х-хромосоме. Эта гипотеза, однако, частично недействительна в семейных случаях RTT, в которых здоровые матери либо являются носителями мутаций по зародышевой линии, либо имеют образующую мутацию гена MECP2. Отличие эпигенетического положения мужских и женских Х-хромосом в половых клетках, однако, может являться ключевым пунктом в понимании разной частоты мутации гена MECP2.

Мутации материнского происхождения и последствия для генетического консультирования

До сих пор во всех известных семейных случаях с наследованием мутаций в гене MECP2, было обнаружено, что мать либо является носителем мутации (Amir др 1999, 2000.Ван и др. 1999; Чидл и др. 2000 года; Мелони др. 2000 года; Orrico др. 2000), либо носителем мозаицизма мутации (Амир др., 1999). В противоположность этому, до сих пор не было описано случаев у пациентов RTT, чтобы рецидивирующая мутация гена MECP2 была наследована по отцовской зародышевой линии. Наши исследования демонстрируют очень высокое преобладание отцовского происхождения мутаций гена MECP2 в спорадических случаях RTT. Вышеупомянутые семейные случаи мутаций гена MECP2 связаны исключительно с материнским наследованием, это предполагает, что мутации, появляясь на материнских аллелях, имеют более высокий риск вызвать семейные случаи RTT. Часть аллелей будет отражать мутации de novo материнской Х-хромосомы, но некоторые из них могут наследовать мутации по материнской линии, либо из-за перекоса Х инактивации, либо из-за мозаицизма, не вызывая очевидного фенотипа матери-носителя. Мы полагаем, что в случаях, когда мутации гена MECP2 наследуются по материнской линии, первоначальное мутационное событие происходит в Х-хромосоме матери, наследуемой ею от её отца.

Недавний доклад Вилларда др. (2000) описывает семью с двумя заболевшими мальчиками и заболевшей девочкой с типичной RTT, и в каждом случае мутация T151M была связана с наследованием мутантного аллеля от матери. В соответствии с нашей гипотезой распространенных мутациях на отцовской хромосоме было найдено, что мутация гена MECP2

в этой семье, по сути, находится на материнской Х-хромосоме, унаследованной ею от отца. Поэтому мы предполагаем, что мутации гена Mecp2 материнского происхождения имеют более высокий процент возможности рецидива, чем мутации гена MECP2 отцовского происхождения. После исключения соответствующих мутаций в материнской ДНК, полученной из лейкоцитов крови, мы предлагаем анализ родительского происхождения мутированных аллелей, чтобы оценить риск возможности повторения, связанный с потенциальной материнской мозаичностью. Тогда, если анализ полиморфного маркера показывает материнское происхождение мутантного аллеля, может быть целесообразным исследовать материнское ДНК, производное от дополнительных тканей (таких как клетки десны и фибробластов). Идентификация мозаичности у матери даёт возможность прогнозировать риск рецидива с 50% вероятностью. Тем не менее, независимо от детектируемой мозаичностью, мы рассмотрим несколько случаев в которых мутации возникают на материнской хромосоме, что даёт более высокой риск рецидива и потому мозаичность половой клетки не может быть исключена. В противоположность этому, если, как в большинстве случаев, происхождение мутации найдено по отцовской линии, то риск рецидива может быть низким, так как с тех пор как было показано, что в спорадических случаях RTT происхождение идёт по отцовской линии и до сих пор не было описано семейных случаев RTT. Тем не менее, возможность мозаицизма в гене MECP2 в отцовской зародышевой линии в целом не может быть исключена априори. В некоторых спорадических случаях по отцовской зародышевой линии мозаицизм был описан для аутосомных расстройств, таких, как нервнофиброматозный тип (Лазаро др. 1994) и незавершённый остеогенез (Кон и др 1990. Эдвардс и др. 1992; Namikawa др. 1995). Генотипирование ДНК из клеток спермы отцов пациентов с RTT может быть полезным подходом для анализа потенциала мозаичности в мужской зародышевой линии. Хотя мы считаем, что риск рецидива низкий для мутаций гена MECP2 отцовского происхождения, перинатальная диагностика должны быть обсуждена и проведена, если это потребуется. В заключение, наши исследования дают убедительные доказательства, что есть небольшой % мужчин с RTT-и не обязательно эти случаи со смертельным исходом, как это предполагалось раннее. Идентификация мутации, возникающей на материнской хромосоме может выявить потенциально семейную форму RTT. Анализ родительского происхождения основных мутаций может быть полезен семьям пациентов с RTT.

Благодарности:

Мы благодарим пациентов с синдромом Ретта и их родителей за их участие.

Перевод: Ксения Болтинова. Православная гимназия г. Кемерово, учитель английского языка.

17.09.2015 08:56